层析法介绍（二）

　　干柱层析
　　将干吸附剂（未与洗脱剂混合）装柱，设法将样品加到上面，从柱项加入洗脱剂，使洗脱剂往下移动至柱底，使待分离的成分层析、展开。早在20世纪初，干柱层析就有应用，但一直未被重视。后来由于寻找高效的制备性薄层的需要，人们发现干柱层析能在一根层析柱上迅速地进行制备性分离，分离效果与制备性薄层层析相似，可以将薄层层析的分离条件直接用于干柱层析，从而分离出更多量的化学成分。
　　干柱层析有塑料膜柱和玻璃柱两类，塑料常为聚乙烯薄膜。目前，干柱层析已经广泛用于实验室制备性分离。其优点是：分离效率高，分离条件可用薄层摸索，如果直接套用薄层最佳的分离条件，即可得到与薄层基本相同的分离效果。

　　聚酰胺层析
　　聚酰胺材料简介：
　　聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，聚酰胺又称锦纶、尼龙、种类繁多。层析常用的为锦纶－6和锦纶－66。其单体物质是已内酰胺、已二胺和已二酸。分子中的酰胺键是其结构的重要部分。酰胺键也是与其它极性键基团产生氢键的物质基础。
　　聚酰胺层析的基本原理：聚酰胺层析属于吸附层析。酰胺键与物质分子中的极性键的相互作用应该是吸附作用的主要原因。值得一提的是分离物质的氢键作用是聚酰胺层析的根本原因，但有些事实说明，非氢键物质也可用聚酰胺进行分离。故聚酰胺的薄层层析原理目前尚未完全阐明。

　　六、离子交换层析
　　定义：利用离子交换树脂（立体网状高分子化合物）做为固定相，流动相携带被分离的离子型化合物，在离子交换树脂上进行离子交换，从而达到分离及提纯的色谱法。
　　网状结构的骨架部分简称网架，它的性质很稳定，对酸、碱及某些有机溶剂、氧化剂、还原剂都具有一定的稳定性，对热也比较稳定。在网架结构的骨架上，有许多可以与溶液中的离子起交换作用的活性基团，称作交换基。
　　离子交换树脂的分子结构中，由两大部分构成：稳定的网架及网架上的交换基。
　　（一）分类：根据交换基结合离子的性能不同将离子交换树脂分为两类：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂。每类中根据交换基（分析化学中称为功能基）的活性不同又分为强酸、弱酸型；强碱、弱碱型。
　　（二）组成：离子交换树脂可由树脂母体和交换基团构成。常见的是聚苯乙烯树脂作为母体。相关结构图示略。
　　（三）离子交换层析的原理：交换基上的活性离子（H+或OH-）在水溶液中与其它阴、阳离子的可逆交换来达到逐步分离的目的。
　　当两种（或两种以上）不同的可交换物质离子通过离子交换树脂柱时，各不同成分的亲和力不同，在柱上的交换速度也不同，被洗脱的时间也就不同，从而达到分离目的。
　　（四）离子交换树脂的性能：
　　1．交联度：离子交换树脂中所含的交联剂的百分率。
　　例如：上海树脂厂生产的聚苯乙烯强酸型阳离子交换树脂，从其产品牌号：　732（强酸1×7）可以得知，交联度为7%（1×7）。
　　2．交换容量：单位质量的离子交换树脂中毫摩尔数。单位为mmol/g。
　　交换容量是用来表示离子交换树脂进行交换离子的能力大小的，其数值大小决定于以树脂表面及网状结构内部所含的交换基的多少。
　　3．溶胀性：指树脂吸收水分后，浸润膨胀能力的大小。
　　操作步骤：离子交换层析法主要用于柱层析（也可用于薄层层析）。
　　4．装柱：柱底垫玻璃丝或脱脂棉，将事先用水溶胀并洗涤干净的离子交换树脂（如果是新购商品一定要先进行预处理，详细操作见树脂的预处理与再生）与水的混合物灌入柱内。要求均匀、密实、无气泡。
　　5．交换：在柱顶放置一层玻璃丝，下端徐徐放液，同时将样品溶液慢慢倒入柱内。
　　注意：所加入的样品溶液中被交换成分的毫摩尔数，应与柱内所加的离子交换树脂的总容量相适应，经验比例为：加入量占总交换容量的阳1/2、阴1/4，1/3。具体换算详见交换容量。
　　6．洗脱：用合适的洗脱剂从上端加入，使样品中各种不同的成分先后流出，分段定量收集洗脱液，可得单一成分的化合物。
　　（五）树脂的预处理与再生：将含有可溶性小分子有机物和铁、钙等杂质的商品离子交换树脂中的上述杂质除去，同时将其盐型转化成可用的游离型处理过程。
　　1．树脂的预处理：商品树脂浸泡在蒸馏水中1－2天（其间可滤过换水1－2次），将该溶胀后的树脂装柱，再根据交换类型进行不同处理。阴阳离子的处理　　方式分别如下：
　　（1）阳离子交换树脂的预处理：
　　钠型（又称盐型）→10倍量或20倍量1mol/L的HCI溶液转型交换→蒸馏水洗至中性→10倍量的1mol/L的NaOH恢复成钠型→蒸馏水洗→10倍量或20倍量1mol/L的HCI溶液再转型交换→再用蒸馏水洗至中性→10倍量的1mol/L的NaOH再次恢复→再次重复1次上述过程。最后成为H型。
　　（2）阴离子交换树脂的预处理：
　　氯型（又称盐型）→10倍量或20倍量1mol/L的NaOH溶液转型交换→蒸馏水洗至中性→10倍量的1mol/L的HCI恢复成氯型→蒸馏水洗→10倍量或20倍量1mol/L的NaOH溶液再次转型交换→再用蒸馏水洗至中性→10倍量的1mol/L的HCI再次恢复→再次重复1次上述过程。最后成为OH型。详见P46
　　2．树脂的再生：树脂长期使用，当它的交换基大部分已经交换了离子后，就会失去交换能力而失效，需要适当处理使交换基上的已交换离子了（如钙、镁离子等）变成可继续交换的游离型交换基离子（H＋及OH－）。这个过程叫离子交换树脂的再生。此再生过程可以进行多次，直至离子交换树脂的颗粒发生严重破损，不能再用为止。
　　树脂再生的原理与预处理大体相同。

　　葡聚糖凝胶层析
　　中药化学成分分子大小各异，分子量从几十到几百万。可根据这一性质用透析法、凝胶过滤法，超滤法、超速离心法等分离中药化学成分。前两者是利用半透膜的膜孔或凝胶的三维网状结构的分子筛的过滤作用；超滤法是利用因分子大小不同引起的扩散速度的差别；至于超速离心法则是利用溶质在超速离心作用下具有不同的沉降性或浮游性。以上这些方法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖类的脱盐精制及分离工作，对分离小分子化合物来说不太适用。可是凝胶过滤法可用于分离分子量在1000以下的化合物。
　　凝胶过滤法分离物质的原理：凝胶过滤法为（gel filtration）也叫凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、排阻色谱（exclusion chromatography）,系利用分子筛分离物质的一种方法。其中所用的载体，如葡聚糖凝胶，是在水中不溶、但可膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。当在水中充分膨胀后，装入色谱柱中，加入样品混合物，用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限制，大分子将不能渗入凝胶颗粒内部（即被排阻在外）而在颗粒间隙移动，并随溶剂一起柱底流出；小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，故通过色谱柱时阻力增大、流速变缓，将较晚流出。
　　样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入到凝胶颗粒内部的程序也不尽相同，故在经历一段时间流动并达到支柱平衡后，即铵分子由大到小顺序先后流出并得到分离。
　　凝胶的种类和性质：商品凝胶虽然很多，但常用的凝胶有如下两种：葡聚糖凝胶（Sephadex－G）和羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex-LH-20)。
葡聚糖凝胶（Sephadex－G）只适于在水中应用，且不同规格适合分离不同分子量的物质。羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex-LH-20)为葡聚糖凝胶（Sephadex－G－25）经过羟丙基化后得到的产物，除保留有Sephadex－G－25原有的分子筛特性，可铵分子量大小分离物质外，在由极性和非极性溶剂组成的混合物中常常起到反相分配色谱的作用，适用于不同类型有机物的分离，在中药化学成分的分离中得到了越来越广泛的应用。

　　加压液相柱色谱
　　经典的液－液分配柱色谱中用的载体（如硅胶）颗粒较大（100－150μm），流动相仅靠重力作用自上向下缓缓流过色谱柱，流出液用人工分段收集后再进行分析，因此柱效较低，费时较长。近年来，已经逐渐被各种加压液相色谱所代替。
　　加压液相色谱用的载体多为颗粒直径较小、机械强度及比表面均较大的球形硅胶微粒，如Zi-pax类薄壳型或表面多孔型硅球以及Zorbax类全多孔硅胶微球，其上键合不同极性的　有机化合物以适应不同类型分离工作的需要，因而柱效大提高。
　　加压液相色谱铵加压强弱可以分为快速色谱（flash chromatography,约2.02×105Pa）、低压液相色谱（LPLC，＜ 5.05×105Pa＝、中压液相色谱（MPLC，5.05×105Pa－20.2×105Pa）及高压液相色谱（HPLC，＞ 20.2×105Pa）。
　　加压液相色谱法作为一种现代分离分析方法，在中药有效成分研究中应用广泛。近来，中低压液相柱色谱装置及E.Merck公司生产的配套用Lobar柱因分离规模较大（可达克数量级）、分离效果好（有时不亚于HPLC所得结果）、分离速度较快（填充颗粒较大，约40－60μm）、分离条件可由相应的TLC结果直接选用、价格比较便宜、操作简便的特点，而很受用户欢迎。